什么是物镜的同焦现象?它在显微镜观察中的意义

光学显微镜是一种既古老又年轻的科学工具,从诞生至今,已有三百年的历史光学显微镜的用途十分广泛,例如在生物学中,化学中,物理学中,天文等等在一些科研工作中都是离不开显微镜.
目前,几乎成了科学技术的形象代言,你只需看媒体上有关科学技术的报道中频频出现其身影,便可见此言之不谬也.
生物学中,实验室是离不开这种实验仪器,它可以帮助学习者去研究未知的世界；去认识世界.
医院是显微镜的最大应用场所,主要用来检查患者的体液变化、入侵人体的病菌、细胞组织结构的变化等等信息,为医生提供制定治疗方案的参考依据和验证手段,在基因工程、显微外科手术中,显微镜更是医生必备的工具；农业方面,育种、病虫害防治等工作离不开显微镜的帮助；工业生产中,精细零件的加工检测和装配调整、材料性能的研究是显微镜可以的显身手的地方；刑侦人员常常依靠显微镜来分析各种微观的罪迹,作为确定真凶的重要手段；环保部门检测各种固体污染物时也得助显微镜；地矿工程师和文物考古工作者借助显微镜所发现的蛛丝马迹可以判断深埋地下的矿藏或推断出尘封的历史真像；甚至人们的日常生活也离不开显微镜,如美容美发行业,能用显微镜对皮肤、发质等进行检测,当能获得最佳的效果.可见显微镜与人们的生产生活结合得是多么的紧密.
按照不同的应用目的,可以大致对显微镜进行分类,常见的有生物显微镜、金相显微镜、体视显微镜、偏光显微镜等四大类.顾名思义,生物显微镜主要用在生物医学方面,观察对象多为透明或半透明微体；金相显微镜主要用来观察不透明物体的表面,如材料的金相结构和表面缺陷；体视显微镜在将微物放大成像的同时,还使物与像相对于人眼的方位一致,并且有纵深感,符合人的常规视觉习惯；偏光显微镜利用不同材料对偏振光的透射或反射特性来区分不同的微物组份.另外,还可细分出一些特殊的种类,如倒置生物显微镜或称培养显微镜是主要用来透过培养器皿底部观察培养的一种生物显微镜；荧光显微镜利用某些物质吸收特定较短波长光线而发射特定较长波长光线的特性,去发现这些物质的存在,判断其含量；比较显微镜可以在同一视场中形成两个物体的并列或重合图像,以便对比两个物体的异同.
传统的光学显微镜主要由光学系统及支撑它们的机械结构组成,光学系统包括物镜、目镜和聚光镜,都是由各种光学玻璃做成的复杂化了的放大镜.物镜将标本放大成像,其放大倍率M 物由下式决定： M物 =Δ∕f'物 ,式中 f'物是物镜的焦距, Δ可理解为物镜与目镜间的距离.目镜将物镜所成之像再次放大,成一个虚像在人眼前 250mm 处供人观察, 这是多数人感觉最舒适的观察位置,目镜的倍率M 目 =250/f' 目,f' 目是目镜的焦距.显微镜的总放大倍率是物镜与目镜的乘积,即 M=M 物*M 目=Δ*250∕f' 目 *f; 物.可见,减小物镜及目镜焦距将使总放大倍率提高,这是用显微镜可以看到细菌等微生物的关键, 也是其与普通放大镜的区别所在.
那么,是否可以设想无限制地减少 f' 物f' 目,以便提高放大倍率,使我们能看到更加细微的物体呢 ? 回答是否定的!这是因为用以成像的光本质是一种电磁波,因而在传播过程中免不了产生衍射和干涉现象,就像日常所见水面的波纹遇到障碍时能绕行,两列水波相遇时能互相加强或削弱一样.当从一个点状的发光物点发出的光波进入物镜时,物镜的边框阻碍了光的传播,产生衍射和干涉,经物镜后无法再会集于一点,而是形成有一定大小的光斑,外围还有强度微弱并逐渐减弱的一系列光环,我们称中心亮斑为艾里斑,两个发光点靠近到一定距离时两光斑就会重叠,直至无法确认为两个光斑.瑞利提出了一个判定标准,认为当两光斑中心相距等于艾里斑半径时,两光斑是能分辨的,经计算,这时候两个发光点间的距离 e=0.61 入∕n.sinA=0.61 入 ∕N.A ,式中,入为光波波长,人眼可接收的光波波长约为0.4—0.7um ,n 为发光点所处介质的折射率,如处在空气中, n≈1 ,处在水中,n≈1.33 ,而 A 为发光点对物镜边框张角之半,N.A 称为物镜的数值孔径.从上式可见,物镜能分辨的两点间的距离受到了光的波长和数值孔径的限制,由于人眼视觉最敏锐的波长约为 0.5um ,而A 角不可能超过90 度, sinA 总小于1 ,对于可用的透光介质最大折射率约为1.5 ,故 e 值始终大于0.2um ,这是光学显微镜能分辨的最小极限距离.通过显微镜放大成像,若想将能被具有某些 N.A 值的物镜分辨率的物点间距e 放大到足以被人眼分辨,则需M.e≥0.15mm ,此处 0.15mm 为实验得出的人眼能分辨的置于眼前250mm 处两微物间的最小距离,故 M≥ （0.15∕0.61 入）N.A≈500N.A ,为使观察不致太费力, M 扩大一倍便足够了,即500N.A≤M≤1000N.A ,是显微镜总倍率的合理选取范围,再大的总放大倍率是没有意义的,因为物镜数值孔径已经限制了最小可分辨距离,提高放大倍率已不可能分辨出更小的物体细节了.
成像衬度是光学显微镜的另一个关键问题,所谓衬度,即是像面上相邻部份间的黑白对比度或颜色差,人眼对于0.02 以下的亮度差别是很难判定的,对颜色差别则稍微敏感一些.有些显微镜观察对象,如生物标本,其细节间亮度差别甚小,加之显微镜光学系统设计制造误差使其成像衬度进一步降低而难于分辨,此时,看不清物体细节,不是总放大倍率过低,也不是物镜数值孔径太小,而是由于像面衬度太低的缘故.
多少年来,人们为提高显微镜的分辨能力和成像衬度付出了艰辛的劳动,随着计算机技术和工具的不断进步,光学设计的理论和方法也在不断改进,加上原材料性能的提高,工艺和检测手段的不断完善,观察方法的创新,使光学显微镜的成像质量已经接近衍射极限的完善程度,人们将用标本染色、暗场、相衬、荧光、干涉、偏光等观察技术,使得光学显微镜已能适应形形色色标本的研究,虽然近年来电子显微镜,超声显微镜等放大成像仪器先后问世,在某些方面具有优势的性能,但在廉价、方便、直观、特别是适合生物活体的研究等方面仍无法与光学显微镜匹敌,光学显微镜仍然牢固地占据着自己的阵地.另一方面,与激光、计算机、新材料技术、信息技术相结合,古老的光学显微镜正焕发青春,显示了旺盛的生命力,数码显微镜、激光共焦扫描显微镜、近场扫描显微镜、双光子显微镜及具有各种新的功能或能适应各种新的环境条件的仪器层出不穷,更加扩大了光学显微镜的应用领域,作为最新的例子.从火星探测车上传回的岩层显微图片是多么令人振奋!我们完全可以相信,光学显微镜将会以更新的姿态,造福人类.
由于近场光学显微镜能克服传统光学显微镜低分辨率以及扫描电子显微镜和扫描隧道显微镜对生物样品产生损伤等缺点,因此得到了越来越广泛的应用,特别是在生物医学以及纳米材料和微电子学等领域.
高分辨率光学成像由于近场光学显微镜对所观察的生物样品无损伤等优点,因此被广泛应用于生物样品的观察,成为探索生物大分子活动奥秘的光学手段,给生物学家们带来强有力的实验武器.利用近场光学显微镜,已在生物学研究所涉及的许多领域展开了工作,不仅有静态的形貌像的观察研究,如细胞的有丝分裂,染色体的分辨与局域荧光,原位 DNA,RNA 的测序,基因识别等,还有利用观察形貌像随时间变化的动力学过程的研究.下面我们将举例说明近场光学显微镜在生物分子研究的具体应用
1、 单个荧光分子的标记
2、 高密度信息存储
3、 近场光谱

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