超分辨率显微镜的实现

超分辨率显微镜作为荣获诺贝尔奖的一项创新，允许成像低于光的衍射极限，使微小的生物结构显示出一些令人惊叹的清晰视图。但超分辨率显微镜得到的图像不是你在典型的生物实验室中看到的东西——相反，它需要复杂而昂贵的工具和大量的图像后处理。

现在，澳大利亚麦考瑞大学ARC纳米级生物光子学卓越中心（CNBP）的研究人员开发了一种方案，他们认为这种方案可以为生物实验室中普遍存在的标准共聚焦显微镜带来三维亚衍射成像能力（Nat .Commun，doi：10.1038 / s41467-019-11603-0）。该团队称之为上转换超线性激发-发射（uSEE）显微镜的技术依赖于所谓的上转换纳米粒子（UCNP）作为荧光标记的巧妙用途，其在被低功率近红外光激发时提供尖锐，可调的窄发射。

澳大利亚麦考瑞大学的一个研究小组已经概述并测试了一种系统，该系统使用上转换纳米颗粒（UCNP）作为“超线性”荧光团，可以通过传统的共聚焦显微镜设置在低激光功率下实现超分辨率成像。

超线性发射器

通过使用“超线性”发射器在共焦显微镜上实现超分辨率的想法实际上可以追溯到几十年前。实质上，这些发光标记构成一类材料，其荧光发射超线性地取决于激发激光的功率。这在实践中意味着，当相对低功率的激光束撞击超线性发射器时，只有光束强度最大的光束轮廓的中心将刺激显着的发射。反过来，这表明发射区域的尺寸将小于光束轮廓本身，从而导致更清晰的分辨率。材料越超线性，分辨率越高。

但是，如果很容易将这种超线性路径的原理说明为超分辨率，那么找到合适的超线性纳米粒子作为真实成像系统中的荧光团就更加困难了。一个原因是候选纳米颗粒众多，例如发光纳米金刚石和量子点，其仅在可见波长中显示出超线性发射，因此它们对于强烈散射生物系统中的成像不太有用。以前的候选粒子也需要复杂的程序或高功率的，因此具有潜在的对细胞损伤的激光来实现超线性发射。

目光转向UCNP

像许多其他团队一样，由Denitza Denkova和Martin Ploschner领导的Macquarie的CNBP团队想知道另一类纳米颗粒（UCNP）是否可以作为超线性荧光团用于成像。UCNP是核-壳纳米颗粒，其能够吸收近红外波长的光，然后以较低波长（因此，较高频率）的可见光和UV光重新发射能量。除了它们的NIR激发波长，UCNP还有另一个优点：它们可以显示超线性发射特性，无需复杂的程序或高激发功率。

CNBP科学家们研究了一种特殊的荧光团候选物：掺杂20％Yb和8％Tm的NaYF4 UCNPs。然后，该团队进行了一系列复杂的计算机模拟，以计算在给定激发光束下对给定超线性荧光团成像时可能出现的轴向和横向分辨率增强。

接下来，该团队使用传统的共聚焦显微镜配置，通过在实验室的活神经细胞中成像NaYF4 UCNP来试验该系统。据报道，该实验在轴向和横向空间方向上产生的图像超过衍射极限两倍。

低光子数预算→高分辨率

CNBP团队系统的一个特别有趣的方面是，与其他超分辨率技术相比，提高分辨率需要增强激光功率——uSEE成像通过降低光子数来实现子衍射成像的改进。这种违反直觉的发现对该技术的有用性具有一些重要意义，特别是在对活体生物样品进行成像时，高激光能量可导致光毒性和细胞损伤。“我们的方法与所有其他现有的超分辨率方法的工作方向相反，”联合主要作者Denkova在随同研究的新闻稿中指出。 “激光功率越低，分辨率越高，对生物样本造成光损伤的风险越低。”她补充说，由于系统不需要进行任何设置修改或图像处理，因此它“有可能适用于任何一个生物实验室，且几乎不需要额外费用。“

该团队指出，虽然他们的演示依赖于UCNP作为超线性发射器，但所涉及的原理可以扩展到显示超线性行为的其他类型的发射器。实际上，研究人员提出，他们的理论建模可以帮助开发“新型超线性发射器”，这种发射器可能在短期内出现。作者认为，他们的理论工作和实验室演示标志着“三维超分辨率成像作为日常实验室工具”具有可观的前景。