共聚焦显微镜基本工作原理及其结构

    从一个点光源发射的探测光通过透镜聚焦到被观测物体上，如果物体恰在焦点上，那么反射光通过原透镜应当汇聚回到光源，这就是所谓的共聚焦，简称共焦。共焦显微镜在反射光的光路上加上了一块半反半透镜（dichroic mirror），将已经通过透镜的反射光折向其它方向，在其焦点上有一个带有“针孔”（Pinhole）的挡板，小孔就位于焦点处，挡板后面是一个光电倍增管（photomultiplier tube，PMT）。可以想像，探测光焦点前后的反射光通过这一套共焦系统，必不能聚焦到小孔上，会被挡板挡住。于是光度计测量的就是焦点处的反射光强度。其意义是：通过移动透镜系统可以对一个半透明的物体进行三维扫描。这样的构想，是在1953年，美国学者马文·明斯基提出，经过了30年的发展，才利用激光为光源，发展出符合马文·明斯基理想的共聚焦显微镜。

    共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）使用激光作为扫描光源，逐点逐行扫描，以面对面的方式快速扫描图像。扫描的激光和荧光收集共享一个物镜。物镜的焦点是扫描激光的焦点，也是瞬时成像的目标点。

    系统聚焦一次，扫描限于样品的一个平面。当聚焦深度不同时，可以获得样品的不同深度水平的图像。图像信息存储在计算机中，可以通过计算机分析和模拟显示细胞样本的三维结构。

    在结构配置中，激光共聚焦显微镜包括普通光学显微镜的基本结构，包括激光光源，扫描装置，检测器，计算机系统（包括数据采集，处理，转换，应用软件） ）和图像。

    输出设备，光学设备和共聚焦系统等。该仪器具有分辨率高，灵敏度高，“光学切片”，三维重建，动态分析等优点，为基础医学和临床研究提供了有效手段。此外，CLSM对荧光样品的观察具有显着优势，只要可以用荧光探针标记的样品可用于观察。

    激光共聚焦扫描显微镜可用于观察细胞形态，细胞生化成分的定量分析，光密度统计和细胞形态测量。它可用于局部稳定系统的长期活细胞动态观察。

    在普通的宽视场光学显微镜中，整个样品由水银弧光灯或氙灯照射，可以用肉眼直接观察图像[5]。同时，来自焦点以外的其他区域的荧光对结构具有很大的干扰，特别是当样品的厚度大于2um时。

    激光共聚焦显微镜与常规光学显微镜的场源和局部平面成像模式分离。使用激光束作为光源，激光束通过针孔照射，被分束器反射到物镜，并聚焦在样品上，扫描样品焦平面上的每个点。

    如果在组织样本中存在可以被激发的荧光物质，则被激发后发出的荧光通过原始入射光路径直接反转回分束器，并且首先通过检测针孔来聚焦，并且聚焦光是由光电倍增管（PMT）检测。

    收集信号并将其发送到计算机并在处理后在计算机显示屏上显示图像。在该光路中，只有焦平面中的光可以穿过检测针孔，并且来自焦平面外部区域的光在检测孔的平面内失焦，并且不能过小孔。

    因此，非观察点的背景是黑色，对比度增加，并且成像清晰。由于照明针孔和检测针孔相对于物镜的焦平面共轭，焦平面上的点同时聚焦在照明针孔和检测针孔上.

    并且焦平面外的点不在成像点处成像。探针针孔，即Focus 。激光器用作光源并扫描样品。在此过程中，它被聚焦两次，因此被称为激光扫描共聚焦显微镜。